Single Molecule Biophysics of DNA and DNA-ligand interaction
- Reference number
- ICA08-0012
- Start and end dates
- 090910-131231
- Amount granted
- 2 678 574 SEK
- Administrative organization
- Göteborg University
- Research area
- Life Science Technology
Summary
Our goal is to mechanistically understand DNA and interactions between DNA and other molecules on the single molecule level. The main approach will be to study DNA extended in nanoscale confinements using fluorescence microscopy. We will investigate the local conformation of DNA confined in nanochannels using the polarization of the emitted light from intercalating DNA dyes. The difference in emission polarized parallel and perpendicular to the nanochannel is dependent on the rigidity of the backbone and we can hence deduce how the stiffness of the DNA backbone is affected by binding of drugs and proteins. DNA is to a very large extent confined in nature and studies in this totally artificial system might to understand confined DNA in vivo. We will also develop a fast, label-free approach to study sequence selectivity and on single DNA molecules based on competitive binding. The principle will be demonstrated for a small molecule that binds strongly to DNA with a high AT-selectivity and we intend to expand the method to studies of DNA-binding proteins. Further, we will use a complementary single molecule technique, optical tweezers, to investigate threading of ruthenium-based ligands into DNA, with special emphasis on how small structural modifications of the ligands affect the threading process. Threading is a mechanism that has fundamental importance in designing new DNA-binding drugs.
Popular science description
Projektet kommer att vara inriktat mot att studera hur DNA växelverkar med andra molekyler och allt från små läkemedelsliknande molekyler till stora proteiner kommer att undersökas. Ett viktigt redskap i studien kommer vara att studera DNA i kanaler med tvärsnitt som är mindre än en mikrometer. När DNA introduceras i en sådan liten kanal sträcks det ut spontant längs med kanalen och genom att färga in DNAt men fluorescerande molekyler kan man studera de enskilda DNA- molekylerna en och en med hjälp av ett fluorescensmikroskop. Vi har nyligen visat att extra information om DNAts lokala konformation kan fås genom att studera hur fluorescensen är polariserad. Vi har visat att emissionspolarisationen varierar med bredden på kanalen i både grunda och lite djupare kanaler. Mycket arbete återstår dock för att helt förstå förstå hur polarisationen relaterar till DNAts lokala konformation och både experimentella och teoretiska studier ska därför fortsättas under projektets gång. Vi planerar också att använda tekniken för att förstå hur DNA påverkas vid inbindning av andra molekyler, framförallt proteiner. Vi skall därutöver utveckla en metod för att studera sekvensselektivitet hos både små ligander och proteiner i kanalerna på ett sätt som inte kräver att kandidatmolekylen behöver färgas innan studien. Genom tävlingsexperiment mellan kandidatmolekylen och den färgämnesmolekyl som binder till DNAt kan regioner med stort AT-innehåll detekteras som en sänkt emission från just dessa delar av DNAt om kandidatmolekylen föredrar att binda till AT-DNA. Metoden är sedan applicerbar på alla typer av DNA-bindande proteiner eftersom den inte kräver att proteinet färgas. Slutligen skall vi med hjälp av optiska pincetter undersöka hur en speciell typ av DNA-bindande molekyler trär sig igenom DNAt. Det är en fundamental process som är av stort intresse för design av läkemedel. Vi skall undersöka vad som är avgörande för hastigheten genom att göra små strukturella förändringar på en molekyl som binder till DNA på detta sätt.